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文章信息
题目：ZmERF21 directly regulates hormone signaling and stress-responsive gene expression to influence drought tolerance in maize seedlings
刊名：Plant, Cell & Environment
作者：Zhiyong Wang，Ruixin Shao, Lixia Ku et al.
单位：Henan Agricultural University
日期：06 December 2021
01
摘要
干旱胁迫对作物发育和产量产生不利影响。玉米在其生命周期中经常遇到干旱胁迫。提高耐旱性是玉米育种计划的重点。在这里，我们鉴定了一种新的转录因子编码基因，APETALA2 ( AP2 )/乙烯反应因子(ERF)，它与玉米幼苗的耐旱性密切相关。聚乙二醇处理可高度诱导ZmERF21在根和叶中表达。遗传分析表明，zmerf21突变植物表现出降低的耐旱表型，伴随着在干旱条件下常见的表型和生理变化。ZmERF21在玉米中的过表达显着增加了干旱条件下的叶绿素含量和抗氧化酶的活性。RNA-Seq和DNA亲和纯化测序分析进一步表明，ZmERF21可能通过与潜在靶基因的启动子结合，直接调控激素（乙烯、脱落酸）和Ca信号相关基因以及其他应激反应基因的表达。因此，我们的结果提供了ZmERF21参与玉米干旱胁迫反应的分子证据。
02
技术路线
03
主要结果
3.1 PEG模拟干旱胁迫下zmerf21突变体的变异
稳定插入Ds转座子的郑58遗传背景的幼苗经20% PEG诱导干旱胁迫4天。结果表明，在具有郑58遗传背景的100个MU家族中，郑58-28 MU家族对PEG模拟的干旱胁迫更为敏感（图S1a）。使用 Vollbrecht 等人描述的方法分析了来自 Zheng 58-28 MU 的 Ds 转座子的插入位置。结果表明，郑58-28 MU的Ds插入10号染色体Zm00001d025477基因ATG上游368 bp处（图1b）。Zm00001d025477 是一个 ETH 响应的 TF ERF21（命名为 ZmERF21）。因此，郑58-28 MU更名为zmerf21-1。此外，具有Zheng 58遗传背景的其他100个MU家族之一的Ds插入ZmERF21的ATG下游42 bp，MU家族命名为zmerf21-2（图1c）。此外，通过PCR确认了zmerf21-1和zmerf21-2突变体中Ds的插入位置（图S2）。
为了确定 zmerf21-2 是否与干旱相关，WT 和 zmerf21-2 幼苗也经过20% PEG处理 4 天（图 1a，d）。结果表明，与 WT 相比，两个 MU 品系表现出更短的表型、更小的叶面积和更低的干重（图 S1b；表 S2）。qPCR检测结果表明，正常条件下ZmERF21在玉米郑58根、叶和茎中的表达水平相似，而PEG-模拟干旱胁迫下，ZmERF21在根中表达水平最高，其次是叶，在茎中表达水平最低。
我们在 maize BAR ePlant Database 中搜索 ZmERF21，发现 ZmERF21 主要在叶片（V9）中表达，并且 ZmERF21 的表达模式可被干旱、盐分、温度和生物胁迫诱导。这些与ZmERF21参与干旱胁迫的结果一致。测量生理变化，包括叶片中的 RWC、光合活性和抗氧化酶活性 (图 1e-g)。在遭受 PEG 模拟的干旱胁迫后，与 WT 植物相比，两个 MU 系中的水分状况、Chl 和 Car 含量显着降低（图 1e）。此外，JIP 测试分析（即 OJIP 多相瞬时上升分析）表明，在干旱诱导 4 天后，两个 MU 系的 Fv/Fm 值迅速下降（p < 0.01 ），而WT没有显着变化（图1f）。同样，在 PEG 模拟干旱处理期间，两个 MU 系的 PI值低于 WT 植物的值（图 1f），表明 PSI 和 PSII 的光化学效率在两个 MU 系中受到干旱的损害。此外，在 PEG 模拟干旱胁迫下，两种 MU 系的 SOD、POD 和 CAT 等抗氧化酶系统的活性显着低于 WT（图 1g）。总的来说，zmerf21-1 和 zmerf21-2 植物中这些一致观察到的生理表型表明 ZmERF21 增强了耐旱性。
Fig. 1
3.2 ZmERF21 调节干旱诱导、激素反应和光合作用基因
为了研究涉及 ZmERF21 响应干旱胁迫的调控网络，比较了正常和 PEG 模拟干旱胁迫条件下幼苗期 WT 和 zmerf21-2 植物叶片的转录组.总共从 8 个 cDNA 文库中生成了 5.04 – 740 万条reads，超过 90% 的reads被唯一地映射到参考基因组 B73 V4（表 S3）。为了验证在 RNA-Seq 中观察到的正常和 PEG 模拟干旱胁迫条件下 WT 和 zmerf21-2 之间的表达差异，通过 qPCR 确认了从 RNA-Seq 转录组数据中鉴定的 20 个差异表达基因（表 S4）。结果表明，从 RNA-Seq 数据确定的基因表达差异是可靠的（图 2a）。从 RNA-seq 数据中，我们确定了 590 个 DEG。在590个基因中，494个基因在干旱胁迫下WT和zmerf21-2之间表现出显着的差异表达模式，而在非胁迫条件下WT和zmerf21-2之间没有显着差异。在非胁迫条件下，86 个基因在 WT 和 zmerf21-2 之间表现出显着的差异表达模式，但 WT 和 zmerf21-2 之间的显着差异增加。然而，在 WT 和 zmerf21-2 植物中，10 个基因在干旱胁迫和非胁迫条件下表现出相反的表达模式（表 S5）。ZmERF21 的表达水平在 WT 干旱胁迫下最高（图 2c）。
Fig. 2
3.3 ZmERF21靶向基因的鉴定
为了确认 ZmERF21 是否可以激活或抑制基因表达，ZmERF21 在酵母中进行了反式激活分析（图 3a）。发现ZmERF21具有明显的转录激活活性。当与 LexAVP16 融合构建体共转化到原生质体中时，观察到报告基因以高水平表达，该融合载体包含 LexA DNA 结合域的编码序列与 VP16 转录激活域的编码序列框内融合。与之前的报道一致，Gal4 与 IAA17 的转录抑制结构域（IAA17a1）的融合强烈降低了报告基因的表达。然而，报告基因与 ZmERF21-Gal4 融合蛋白（ZmERF21-Gal4）的共转化显着促进了报告基因的表达（图 3b），表明 ZmERF21 是一种转录激活因子。
在这些确定的峰（结合位点）中，34.76%（1851 个峰）位于基因区域，包括启动子区域（TSS 上游-3 kb，24.54%）、内含子区域（2.66%）、外显子区域（ 2.04%）、3'-UTR（3.07%）和下游区域（转录终止位点至 3 kb，2.45%）（图 3d）。基因区域中的 1851 个峰对应于 1407 个基因，ZmERF21 从中与 1143 个基因的启动子区域结合，这些基因主要参与生物调节、信号传导、对激素的反应和对刺激的反应（表 S8）。
为了进一步验证由 ZmERF21 直接调节的推定靶基因的表达水平，我们鉴定了在正常或干旱条件下由 WT 与 zmerf21-2 系产生的 DEG 与上游区域中由 ZmERF21 直接调节的推定靶基因之间的重叠基因（图3e)。我们确定了与 ZmERF21 直接结合的 32 个 DEG，它们可能负责激素信号传导、光合作用 (PH)、CA 信号传导、脱水 (WD)、花青素 (AN) 和多胺 (PA) 的合成。这 32 个基因中有 21 个在 WT 中上调，而其余 11 个基因被下调（表 S9）。这一发现与之前的研究一致（Solovyev et al., 2010; Li et al., 2015）
Fig. 3
3.4 结合基序分析揭示了新的 ZmERF21 顺式元件
Fig. 3f
根据 RNA-Seq 和 DAP-Seq 结果，17 个激素和信号基因是潜在的 ZmERF21 靶标，包括 6 个 ERF 基因、7 个 ABA 反应基因、1 个多胺（PA）反应基因和 3 个 CA 信号通路基因（表 S9）。为了探索 ZmERF21 是否作为不同靶基因的转录激活因子发挥作用，进行了荧光素酶 (LUC) 测定（图 4a；图 S5a）。
为了便于比较 LUC 结果，我们列出了 PEG 模拟干旱胁迫条件下 zmerf21-2 中 ZmERF21 靶基因的表达水平（图 S6；表 S9）。结果表明，ZmERF21显着促进由EREBP105、EREBP122、EREBP126、EREBP142、Chp1、ABA（ABAr1、Platz13、Zinct2、Pdblf1、Nh8）、CA（Pjo2、Pcbpr1、FIP1）启动子驱动的LUC的表达，但抑制其表达由 P-Mo25、Ad1、ABA（ABAr2、Pkkr1）启动子驱动的 LUC 的变化（图 4b-e；图 S5b）。除 P-Mo25、Ad1 和 Pkkr1 外，在干旱胁迫下，与 zmerf21-2 相比，这些靶基因在 WT 中的表达更高；在WT植物中观察到增强的抗旱表型。一致地，qPCR 的结果表明，乙烯相关基因如 EREBP105、EREBP122、EREBP126、EREBP142 和 Chp1 在用 PEG 处理时在 WT 和 zmerf21-2 之间表现出高度显着差异。在 ZmERF21 转基因玉米幼苗的 WT 和 OE 植物中，除 P-Mo25 外，PEG 处理诱导了乙烯相关基因的表达，而它们被 ZmERF21 的突变阻断（图 S7）。同样，在 ZmERF21 转基因玉米幼苗的 WT 和 OE 植物中，Platz13、Zinct2、Pdblf1、Nh8 和 Pkkr1 等 ABA 相关基因的表达被 PEG 诱导，但在玉米中被 ZmERF21 的突变抑制。
Fig. 4
3.6 ZmERF21直接调控干旱响应基因
与胁迫反应相关的10个靶基因（4个PH基因，2个WD基因，2个bHLH基因，2个AN基因合成）在干旱胁迫下WT和zmerf21-2植物之间差异表达。其中，bHLH150、bHLH157-2、FLS2和AN（Adt6，Gpm925）5个基因在zmerf21-2植株中下调，而与光合作用相关的5个基因，即NADPH6、B1B2、Cabbp2、HAD1和Pip2 -1，被上调（表S9）。双荧光素酶瞬时转录活性测定显示，ZmERF21 显着诱导由 bHLH150、bHLH157-2、FLS2 和 AN（Adt6、Gpm925）启动子驱动的 LUC 的表达（图 4e；图 S5b），而抑制由光合作用驱动的 LUC 的表达相关基因（NADPH6、B1B2、Cabbp2、HAD1）和 Pip2-1 启动子（图 4d、e；图 S5b）。这些结果进一步表明，ZmERF21 可能通过直接调控与水平衡和 AN 合成有关的基因，在促进耐旱性方面发挥作用。
3.7 ZmERF21 促进玉米的耐旱性
为推广ZmERF21的应用，产生了ZmERF21转基因玉米幼苗的OE植株。与 WT 相比，OE 系中 ZmERF21 的表达水平高出 1.4-2.4 倍（图 5a）。通过qPCR分析，我们进一步验证了ZmERF21可以直接激活其下游靶标，因为发现其靶基因包括ABA（ABAr1，Nh8），CA（Pcbpr1，FIP1）和Pip2-1的表达水平增加。与我们的假设一致，ABAr1、Nh8、Pcbpr1 和 FIP1 的表达水平与 ZmERF21 的表达水平呈正相关（图 5a）。
此外，我们发现 Pip2-1 的表达水平在 ZmERF21 转基因玉米幼苗的 OE 植物中被部分下调。然后，我们选择了两个独立的 OE 系来进一步分析抗旱性。在 Hoagland 溶液中生长的 20 天龄 WT 和 ZmERF21 OE 植物经受 20% PEG 模拟干旱胁迫 4 天（图 5b）。我们发现这两个 OE 品系表现出更强的抗旱性，因为观察到它们具有更正常的生长和更少的叶片萎蔫症状。例如，与 WT 植物相比，干物质和 RWC 分别增加了 33.6%-33.8% 和 7.0%-8.0%（图 5b、c、e）。生理性状表明，与 PEG 模拟干旱胁迫下的 WT 植物相比，OE 品系的抗氧化酶和 Chl 含量分别增加了 6.7%-23.8% 和 63.1%（图 5d，e）。总的来说，ZmERF21 通过调节激素反应和信号转导基因来改善干旱胁迫。
Fig. 5
3.8 表型数据和 RNA-seq 数据的方差分析
为了确定基因敲除系（zmerf21-1 和 zmerf21-2）和过表达系 35S::ZmERF21（OE1，OE2）是否对施加的胁迫敏感或耐受，我们测量了所有品系的表型（表 S10）。结果显示基因型效应、治疗效应和基因型×治疗效应均达到1%的显着水平。根据F值，显着性水平为：治疗效果>基因型效应>基因型×治疗效果（表S10）。此外，我们对 FPKM 进行了方差分析。在 590 个 DEGs 中，494 个 DEGs 具有显着的处理效果，因为这些基因在 PEG 模拟干旱胁迫下在 WT 和 zmerf21-2 之间表现出显着的差异表达模式。在 96 个 DEGs 中，86 个 DEGs 在非胁迫条件下表现出 WT 和 zmerf21-2 之间的显着差异表达模式，而 WT 和 zmerf21-2 PEG 模拟干旱胁迫之间的显着差异增加；在 WT 和 zmerf21-2 植物中，10 个基因在干旱胁迫和非胁迫条件下表现出相反的表达模式。结果进一步表明ZmERF21在玉米耐旱性调控中起关键作用。
04
结论
总之，在 zmerf21 MU 植物中，玉米幼苗的耐旱表型急剧下降。此外，ZmERF21 在玉米中的过表达显着提高了转基因玉米植物的耐旱性（图 5）。ZmERF21 通过与与干旱、激素反应和信号传导相关的基因的启动子结合来调节其表达，从而在耐旱性中发挥生物学功能（图 6）。本研究为了解 AP2/ERF 家族在玉米中的功能提供了新的见解，并进一步表明其对利用分子育种培育高产玉米品种的潜在可能性。
Fig. 6
05
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END
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