题目：The GhMYB36 transcription factor confers resistance to biotic and abiotic stress by enhancing PR1 gene expression in plants
期刊名：Plant Biotechnology Journal
作者：Tingli Liu, Baolong Zhang
单位：江苏省农科院
摘要
干旱和黄萎病是限制棉花产量的两个重要因素，因此需要确定关键的分基因，以同时提高棉花对黄萎病的抗性和对干旱胁迫的耐受性。R2R3 型的MYB 蛋白可以发挥这种作用，因为它们在植物发育、生长和代谢调节中的始终具有这种功能，然而，迄今为止，尚未在棉花中发现赋予所需的生物和非生物胁迫抗性的MYB基因。
GhMYB36是一种在陆地棉中编码R2R3 型MYB蛋白的基因，它赋予拟南芥和棉花抗旱性和抗黄萎病菌的能力。GhMYB36沉默的棉花植物对干旱胁迫和黄萎病更敏感。GhMYB36在转基因拟南芥和棉花植物中的过表达提高了耐旱性和黄萎病抗性。烟草细胞中融合的GhMYB36-GFP 的瞬时表达能够将GhMYB36定位在细胞核中。此外，在过表达GhMYB36的转基因拟南芥中，RNA-seq分析和qRT-PCR验证显示PR1表达量显着增加。荧光素酶相互作用实验表明，GhMYB36 可能与PR1的启动子结合以激活其表达和相互作用，这进一步通过酵母一杂交测定得到证实。总之，我们的结果表明，GhMYB36作为转录因子发挥作用，通过增强PR1表达，参与拟南芥和棉花的耐旱性和黄萎病抗性。
技术路线
主要结果
3.1 GhMYB36是棉花耐旱性所必需的
为了研究GhMYB36在耐旱性中的作用，我们使用 VIGS 方法下调了GhMYB36的表达。用作阳性对照的 CLCrV-CHLI 载体处理的植物表现出预期的光漂白表型。通过qRT-PCR分析评估GhMYB36表达的下调。VIGS植物中GhMYB36的表达水平降低到WT的 32.7%，但在空载体 (EM) 植物中没有改变。为了检查其旁系同源物交叉沉默的可能性，选择最接近 GhMYB36 的 NP_001314379.1、XP_016690362.1 和 XP_016722658.1 进行表达评估。如 qRT-PCR 所揭示的，这三个基因的转录物积累在GhMYB36 VIGS 植物中没有受到影响，表明 VIGS 对GhMYB36的特异性下调。然后通过将GhMYB36 -VIGS 植物与 WT 植物一起浸入18% PEG 中 48 小时来模拟干旱情况，并评估它们对渗透胁迫的反应。如图 2a所示，很明显 VIGS后，下调的GhMYB36能够增加植物对渗透胁迫的敏感性，因为GhMYB36-VIGS植物表现出比 WT和EM对照植物相对严重的萎蔫表型。为了量化萎蔫水平，测量了叶片 RWC，在 PEG 处理后，GhMYB36 VIGS 植物中 的叶片 RWC 显着低于WT 和 EM 植物，但保持不变的正常条件（图2b）。
3.2 GhMYB36在拟南芥中的过表达提高了对干旱胁迫的耐受性
为了证实GhMYB36在植物干旱胁迫期间的体内功能，GhMYB36在拟南芥中异源表达。根据卡那霉素抗性筛选出16个T2转基因株系，并通过基因组PCR和RT-PCR验证。通过 PCR、RT-PCR 和蛋白质印迹确认的三个T3系（OE1、OE2 和 OE7）用于检查耐旱性。此外，我们确定了转基因种子在含有甘露醇模拟干旱胁迫的 MS 培养基上的发芽率。转基因种子和在正常培养基上培养的 Col-0 种子之间没有显着差异（图 3a，b），这与过表达GhMYB36的转基因种子形成鲜明对比，与含有 450 mm或 500 mm甘露醇 的培养基上的 Col-0 种子相比，其发芽率显着提高（图3a，b）。
在正常水分条件下，GhMYB36转基因拟南芥幼苗与CK的营养生长和生殖生长均无差异（图 3C）。然而，在脱水30 天后，只有 25% 的CK植物存活，而大多数转基因幼苗表现出正常生长。经过 15 天的干旱处理后，转基因拟南芥中的 T-AOC 显着高于 WT 植物（图 3e），这是GhMYB36赋予拟南芥耐旱性的表现。
3.3 GhMYB36在棉花中的过表达提高了对干旱胁迫的耐受性
相同的GhMYB36过表达载体也通过农杆菌介导的转化转化到陆地棉的基因组中。卡那霉素选择后产生了 16 株源自独立胚性愈伤组织的T0植物，所有这些植物在棉铃数、纤维产量和质量方面都显示出与 WT 植物相似的表型。通过 PCR、Southern 印迹和蛋白质印迹分析证实 GhMYB36构建体整合到棉花基因组中。来自过表达转基因棉花系OX1和OX2的两周龄植物GhMYB36用于停水 14 天时的耐旱性分析。WT 系在早期变得严重褪绿，枯萎，许多无法生存。相比之下，OX1 和 OX2 表现出相当轻微的枯萎症状和比 WT 更少的死亡（图 4a）。再浇水2天后，转基因植物OX1和OX2的成活率分别为65%和75%，明显高于WT（<20%）（图 4b）。这些结果表明 GhMYB36 正向调节拟南芥和棉花的干旱胁迫反应。
3.4 GhMYB36可以提升拟南芥和棉花对黄萎病菌的抗病性
为了评估过表达GhMYB36的拟南芥抗病性，选择了三个转基因系 OE1、OE2 和OE7的3周龄幼苗和 WT对照植物，并接种黄萎病菌。由于 WT 植物表现出典型的V. dahliae感染症状，表现为发育迟缓、萎蔫、萎黄和坏死，但所有转基因植物都明显抵抗这种真菌病，只表现出轻微的症状（图 5a）。表型显然与V. dahliae定植的程度相关，这通过疾病指数和 qPCR 得到证实（图 5b，c）。在V. dahliae处理的两个过表达GhMYB植株（OX1和OX2）的转基因棉花品系中进行了类似的观察（图 5d）。在整个植物发育过程中，OX1 和 OX2 的疾病指数均显着低于 WT，并且表型与V. dahliae定殖的程度相关，这已通过 qPCR 验证（图 5e ， f）。总之，这些实验令人信服地证明了 GhMYB36 在赋予拟南芥和棉花黄萎病菌抗性方面的潜在功能作用。
3.5 GhMYB36是细胞核定位蛋白，通过与 PR1 启动子结合来激活PR1基因的表达
为了确定GhMYB36的细胞定位，通过在本氏烟中使用农杆菌浸润进行 GhMYB36-GFP 融合蛋白的瞬时表达。如图 7a所示，检测到代表 GhMYB36 定位的 GFP与细胞核中的 DNA 特异性荧光染料 DAPI 共定位。
在干旱处理或黄萎病菌攻击下对GhPR1进行VIGS下调以进一步检查 PR1 功能。在农杆菌介导的 VIGS 浸润三周后，qRT-PCR 分析显示GhPR1表达显着降低（图 8b）。因此，GhPR1 VIGS棉花植物变得更容易感染V. ahlia (图 8a ) 并在干旱胁迫下显示出比对照植物更严重的萎蔫表型。
总结
GhMYB36 作为转录因子发挥作用，可提高拟南芥和棉花的耐旱性和黄萎病抗性。虽然GhMYB36 响应干旱和V. dahliae的活性机制归因于PR1的激活表达，但是存在GhMYB36靶向其他基因以实现其潜在的多样化功能的可能性。该研究不仅阐明了GhMYB36响应生物和非生物胁迫的功能作用的分子机制，而且为分子育种和生物技术进步提供了有效的理论支撑。